第三代測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù)，在測序過程中不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，實現(xiàn)對每一條DNA分子的單獨測序。三代測序技術(shù)具有反應(yīng)速度快、超長讀長，無模板擴(kuò)增、直接檢測表觀修飾位點、測序錯誤隨機(jī)出現(xiàn)，沒有GC或修飾的偏好性等特點。諾賽基因主要應(yīng)用的測序平臺為是Pacific Biosciences (PacBio) 公司的單分子實時測序技術(shù)平臺和Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的單分子納米孔測序技術(shù)平臺。這兩個大平臺也是目前最有代表性的三代測序平臺。
2） 全基因組測序
3） 全長轉(zhuǎn)錄組測序
4） 甲基化測序(具體項目請先咨詢）
（1）單分子測序,大大提高了樣本的通量和檢測的速度；
（2）RNA直接測序，大大降低了體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差；
（3）長片段測序，大大提高DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段）。
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PacBio Sequel 測序平臺
隨著測序技術(shù)的不斷推進(jìn)，以PacBio為代表的第三代基因測序技術(shù)逐漸應(yīng)用到多個科研領(lǐng)域。該平臺是美國太平洋生物技術(shù)公司（Pacific Biosciences）基于納米小孔的單分子讀取技術(shù)，又稱作單分子實時測序技術(shù)（SMRT，Single Molecule Real-Time），無需擴(kuò)增即可快速完成序列讀取。
PacBio Sequel測序儀是2015年10月推出全新升級的第三代測序平臺，該系統(tǒng)較上一代RSII平臺測序體積減少2/3、通量提高7倍、單Gb數(shù)據(jù)成本更低、測序周期更短。2019年4月，該公司重磅發(fā)布新一代測序系統(tǒng)PacBio SequelⅡ，與PacBio Sequel測序系統(tǒng)相比，PacBio SequelⅡ芯片支持8M SMRT Cell ，單張芯片測序通量提升了8倍，并可產(chǎn)出高精準(zhǔn)度的長讀長HiFi reads，堿基準(zhǔn)確度可達(dá)99.9% 以上，具有測序通量更高、耗時更短、準(zhǔn)確度更高、應(yīng)用更靈活等特點。
SMRT技術(shù)應(yīng)用了邊合成邊測序的思想，將測序文庫、DNA聚合酶以及四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP放置在ZMW孔（即零模波導(dǎo)孔Zero-Mode Waveguides）底部，進(jìn)行單個DNA分子的合成反應(yīng)。在測序過程中，以SMRT芯片為測序載體，以共價結(jié)合方式固定的DNA聚合酶和測序模板相結(jié)合，根據(jù)模板鏈核苷酸順序，對應(yīng)的dNTP加入發(fā)生鏈延伸反應(yīng)，通過檢測4種dNTP的熒光信號，以及熒光的波長與峰值分析獲得DNA的堿基序列。
平均讀長10-15Kb，最長可達(dá)40-70Kb，通量~80 Gb/cell，較二代測序平臺讀長更長，有效解決短序列數(shù)據(jù)的拼接難題，且時間更短；在極端高GC和極端低GC區(qū)域，可以輕松測定，從而保證序列覆蓋的完整性和均一性。建庫過程中，DNA不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，避免了覆蓋度不均一和PCR冗余。
（1）全基因組de novo測序
（2）基因組草圖的優(yōu)化或基因組完成圖繪制
（3）全長轉(zhuǎn)錄本測序
（4）宏基因組測序
（5）16S rDNA全長測序
（6）細(xì)胞器基因組測序
（7）全基因組重測序&稀有變異鑒定
（8）表觀遺傳學(xué)
（1）高質(zhì)量總RNA(DNA)的制備；
（2）SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit （Clontech）反轉(zhuǎn)錄，將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，并加接頭序列(DNA直接加接頭）；
（3）文庫構(gòu)建（即環(huán)化）；
（4）上機(jī)測序。
Nanopore測序平臺
Nanopore平臺是牛津納米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，簡稱ONT）研發(fā)的新興實時單分子納米孔測序技術(shù)平臺。用于Nanopore平臺測序的DNA或RNA建庫過程簡單直接，最快的建庫方法只需5到10分鐘就可在樣本分子末端添加測序接頭及馬達(dá)蛋白。具有測序通量更高、耗時更短、準(zhǔn)確度更高、應(yīng)用更靈活等特點。所有Oxford Nanopore測序設(shè)備使用同樣的核心技術(shù)，用戶可以輕松根據(jù)應(yīng)用測試實驗以及擴(kuò)大或縮小規(guī)模。從最小型的Flongle和掌上MinION，到桌面型的GridION和PromethION。所有設(shè)備都可用于進(jìn)行按需測序?qū)嶒?。包括從單次試驗到超高通量項目，全部都可提供快速、長讀長、實時的DNA或RNA直接測序。
ONT測序平臺通過電信號識別堿基序列。當(dāng)DNA/RNA單鏈通過納米孔時，不同的堿基會形成特征性離子電流變化信號，通過對這些信號檢測，可獲得相應(yīng)堿基類型，完成測序。
1. 解螺旋，將雙鏈DNA解開成單鏈；
2. DNA單鏈分子通過一個孔道蛋白，孔道中有個充當(dāng)轉(zhuǎn)換器的蛋白分子；
3. 進(jìn)入納米孔的單分子引起特征性的電流干擾，不同的DNA單分子停留在孔道中就會形成特征性離子電流變化信號， 帶來電流不同的變化；
4.不同的堿基帶來的電流變化是不同的， 轉(zhuǎn)化器蛋白分子可以感受每個堿基的電流變化。
5. 根據(jù)電流變化的頻譜，應(yīng)用模式識別算法得到堿基序列。
理論讀長無限長，試劑讀長受樣品的實際文庫長度限制，DNA/RNA直接測序，目前報到處DNA片段長度最高記錄為>2 Mb，直接RNA測序讀長最長為26kb，MinION通量為20Gb/cell，GridION X5 通量為50-100Gb/cell，PromethION通量為Tb級；文庫制備簡單快速，10 分鐘文庫制備；多種型號可選擇，擴(kuò)增性更強；MinION較Pacbio測序平臺體積小，更便協(xié)調(diào)、易操作；結(jié)構(gòu)變異的檢測更有優(yōu)勢；可對RNA進(jìn)行表達(dá)分析。
（1）全基因組de novo測序
（2）基因組草圖的優(yōu)化或基因組完成圖繪制
（3）全長轉(zhuǎn)錄本測序
（4）宏基因組測序
（5）16S rDNA全長測序
（6）細(xì)胞器基因組測序
（7）全基因組重測序&稀有變異鑒定
（8）表觀遺傳學(xué)
Nanopore測序?qū)嶒灹鞒蹋?/span>
（1）高質(zhì)量總DNA提取；
（2）建庫主要是需要給待測DNA兩側(cè)先加上A堿基，使平末端變成黏性末端，然后再加上Y接頭以及馬達(dá)蛋白；
（3）上機(jī)測序。
測序方案
MinION：
無需等待的即時測序
能在實驗室外進(jìn)行實地測序
達(dá)到每48 小時10-20 Gb數(shù)據(jù)量
MinIno平臺
特點：袖珍型、便攜式生物分析設(shè)備
多達(dá) 512 個納米孔通道
樣本制備只需10 分鐘，簡單快捷
實時分析，工作流程快速高效
適用于 DNA 或 RNA 直接測序
GridION X5：
從事較大的測序項目， 有5 個 MinION 測序芯片（每 48 小時 50-100Gb 數(shù)據(jù)量）
直接在測序儀上進(jìn)行堿基序列讀取——無需輔助設(shè)施。
PromethION：(暫不提供此平臺的服務(wù)）
具有龐大數(shù)據(jù)量的項目 (Tb)
能對大量樣本進(jìn)行按需測序服務(wù)
高通量、高樣本數(shù)的臺式系統(tǒng)
模塊化設(shè)計：多達(dá) 48 個測序芯片，各有多達(dá) 3,000 個納米 孔通道（總計達(dá) 144,000 個）
測序芯片既可單獨也可同時運行
應(yīng)用于大容量樣品測序，工作流程與 MinION相同
1.樣品質(zhì)檢流程是怎樣的？
DNA檢測：Nanodrop檢測→Qubit檢測→瓊脂糖凝膠電泳檢測；
RNA檢測：Nanodrop檢測→瓊脂糖凝膠電泳檢測→Agilent 2100檢測；
文庫檢測：Qubit檢測→Caliper/NGS3K/Agilent 2100檢測→QPCR定量檢測。
2.文庫的最適插入片段長度范圍？
PE150平臺：DNA 350 bp；PE250平臺：270~470 bp; RNA 250~300 bp;SE50平臺： <530 bp（以上片段均指不包含接頭序列的插入片段長度）；
實際文庫制備時，HiSeq文庫大小介于300bp-500bp之間；MiSeq文庫大小介于300 bp-600 bp之間；鳥槍法建庫時，文庫應(yīng)小于1000bp。
3.自建庫有哪些注意事項？
（1）需要客戶提供文庫體積及初步檢測的濃度，并滿足送樣要求；
（2）需提供建庫接頭詳細(xì)正確的序列信息以及正向無誤的index序列，以確保文庫能在測序儀順利上機(jī)以及保證后續(xù)數(shù)據(jù)正常拆分。
4.16S測序哪個區(qū)域比較合適？
目前并沒有絕對的研究表明哪個測序區(qū)域更好。根據(jù)比較權(quán)威的研究表明土壤樣本，16S V4區(qū)（515F-806R）比較適合做擴(kuò)增子研究，可檢測的物種多樣性更豐富，并且可重復(fù)性強（PNAS. 2013. 110(16): 6548-6553.）。Illumina官方推薦的是V3+V4區(qū)。
5.若關(guān)注環(huán)境中的真核微生物多樣性，ITS測序和18S測序哪個更好？
ITS測序主要是針對真菌多樣性的研究，注釋準(zhǔn)確度高；18S測序針對的是真核微生物，注釋到的范圍廣，但是就真菌來說精確度相對較低；可根據(jù)研究目的合理選擇測序方案。
6.擴(kuò)增子與宏基因組的區(qū)別？
擴(kuò)增子主要分為16S、18S、ITS測序，關(guān)注環(huán)境樣本中的物種組成，該技術(shù)物美價廉，實用性高。宏基因組關(guān)注環(huán)境樣本中的物種組成、功能組成及代謝通路等信息，該技術(shù)深入挖掘環(huán)境樣本功能層面的信息。
7..宏基因組與微生物多樣性的區(qū)別？
宏基因組將基因組DNA隨機(jī)打斷成若干條小片段，然后在片段兩端加通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，將得到的reads進(jìn)行組裝后進(jìn)行基因預(yù)測得到基因序列，眾多基因構(gòu)成環(huán)境中微生物的基因集。
微生物多樣性主要針對核糖體小亞基基因序列進(jìn)行測序（16s rDNA或者18s rDNA），該基因既存在高度保守的區(qū)域還包括高變區(qū)，通過特異性引物對某一段高變區(qū)（如V4區(qū)）或某幾段高變區(qū)（如V3-V4區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增測序，然后與數(shù)據(jù)庫比對，可特異性識別細(xì)菌種類。
總的來說，微生物多樣性主要告訴我們環(huán)境里有什么微生物，而宏基因組主要告訴我們環(huán)境里的微生物能做什么。
8.為什么宏基因組與微生物多樣性物種注釋結(jié)果存在差異？
微生物多樣性和宏基因組都會分析環(huán)境中物種的種類，但是物種的豐度在二者之間存在一定的差異： 第一種原因是微生物多樣性是基于核糖體小亞基基因序列進(jìn)行物種注釋和豐度統(tǒng)計，但是在不同物種中核糖體基因的拷貝數(shù)不一樣，這會帶來一些誤差；第二種原因是二者在建庫測序過程中會進(jìn)行PCR反應(yīng)，在PCR這個過程中也會存在一些誤差。
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