二代測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（"Next-generation" sequencing technology NGS），高通量測序以其高輸出量與高解析度的特性，不僅為我們提供了豐富的遺傳學(xué)信息，而且使得測序的費用和時間大大縮短。在基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、宏基因組測序、表觀遺傳測序、外顯子捕獲測序、靶區(qū)域測序等諸多科研及精準醫(yī)療檢測領(lǐng)域內(nèi)有廣泛地運用。
如有對照樣本與實驗樣本的區(qū)分，講明正常樣品與實驗樣品；
如有分組，詳細描述分組分析信息，以及分組比較的分析需求信息。
擴增子測序是一種高靶向性富集基因組中感興趣區(qū)域，用于分析特定區(qū)域中的基因變異的方法。擴增子（目的片段產(chǎn)物）的超深度測序可以有效地識別變異并對其進行特征分析?？傮w思路是靶向地捕獲目標區(qū)域，然后進行新一代測序（NGS），分析測序結(jié)果，得到相應(yīng)信息。
1.癌癥基因測序：靶向癌癥測序側(cè)重于一組精選的基因、基因區(qū)域或擴增子，它們與癌癥有著已知的關(guān)聯(lián)，預(yù)先設(shè)計的集合和定制集合都可用于研究目標靶向基因；
2.疾病篩查：使用NGS可通過同時評估多個基因來發(fā)現(xiàn)遺傳病的致病變異，與傳統(tǒng)方法相比，使用NGS可降低成本，因為傳統(tǒng)方法通常成本較高且不確定，同時需要大量測試；
3.植物和動物測序：預(yù)設(shè)的基因組區(qū)域靶向重測序可以發(fā)現(xiàn)動物和植物中的基因變異，這些變異可能代表了有益的突變，可以幫助做出育種決策，還可能揭示與疾病易感性相關(guān)的突變；
4.微生物組測序：主要采用第二代高通量測序平臺測定16S/18S /ITS高變區(qū)域的序列，來反映環(huán)境樣品中細菌、真菌、古菌分類學(xué)水平上的物種差異，對研究海洋、土壤、腸道等環(huán)境中的微生物群落有重要的指導(dǎo)作用，同時也應(yīng)用于不同的宏基因組學(xué)樣本的系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)研究。
擴增子測序是一種高靶向性富集基因組中感興趣區(qū)域，用于分析特定區(qū)域中的基因變異的方法。擴增子（目的片段產(chǎn)物）的超深度測序可以有效地識別變異并對其進行特征分析。總體思路是靶向地捕獲目標區(qū)域，然后進行新一代測序（NGS），分析測序結(jié)果，得到相應(yīng)信息。
1. 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：疾病與人體微生物間關(guān)系，如代謝類疾病、消化類疾病、自身免疫性疾病、腫瘤癌癥、神經(jīng)類疾病及其他疾病等；
2. 畜牧領(lǐng)域：腸道、瘤胃等微生物群落與動物繁殖、生長發(fā)育、營養(yǎng)健康、免疫和疾病治療等的互作關(guān)系；
3. 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：根際微生物與植物互作、農(nóng)業(yè)耕作/施肥處理與土壤微生物群落等；
4. 環(huán)境領(lǐng)域：某一特定環(huán)境（霧霾、沙塵等污染環(huán)境，住宅、商場等生活環(huán)境）的微生物群落組成，有機肥發(fā)酵處理、污水治理、石油降解、水體及海洋環(huán)境等微生物群落分布和組成等；
5. 特殊極端環(huán)境：極端環(huán)境條件下的微生物類群研究。
1.環(huán)境樣本：土壤5-10g，污泥/沉積物5-10g，水體-濾膜過濾至有可見覆蓋物，糞便3-5g，血液10mL；
2.DNA：總量≥1μg，濃度≥10ng/μL，OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無降解，無污染；
3.送樣管務(wù)必標清樣品編號，管口使用Parafilm膜密封；
4.樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時使用干冰運輸。
在真核生物rDNA中，18S rDNA和28S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔序列稱為ITS，位于18S和5.8S之間的為ITS1區(qū)，位于5.8S和28S之間的為ITS2區(qū)。18S、5.8S和28S的基因序列在大多數(shù)生物中趨于保守，物種間變化小，而轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非轉(zhuǎn)錄區(qū)，在進化過程中承受的自然選擇壓力較小，能容忍更多的變異，在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，可用于真菌分類鑒定。
1.環(huán)境樣本：土壤5-10g，污泥/沉積物5-10g，水體-濾膜過濾至有可見覆蓋物，糞便3-5g，血液10mL；
2.DNA：總量≥1μg，濃度≥10ng/μL，OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無降解，無污染；
3.送樣管務(wù)必標清樣品編號，管口使用Parafilm膜密封；
4.樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時使用干冰運輸。
基因是攜帶遺傳信息的DNA片段，是控制人類生命活動的基本遺傳單位，與人體的生、老、病、死息息相關(guān)。個人基因組檢測是指在基因的層面，對個體遺傳信息進行分析和解讀，評估潛在健康風(fēng)險，幫助實現(xiàn)疾病的早期預(yù)防，從而制定科學(xué)精準的健康管理方案。
1.全基因檢測：全基因組是全部遺傳物質(zhì)的總和，對全基因組進行測序可以破解人體遺傳密碼。全基因組測序可以保存受檢者全部的基因信息，一次檢測受益終身；
全基因組重測序是對基因組序列已知物種的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異信息分析的方法。
2.全外顯子檢測：全外顯子是指基因組中全部外顯子區(qū)域的集合，包含編碼蛋白質(zhì)合成所需要的絕大部分信息，涵蓋了與個體表型相關(guān)的大部分功能性變異。 全外顯子基因檢測技術(shù)是一種針對全外顯子序列進行捕獲和高深度測序，從而找到致病突變，或與疾病相關(guān)的新基因，涉及全身各大系統(tǒng)，是一種非常精密的疾病檢測方法，具有高準確性和高靈敏度的特點；
3.加強全外顯子檢測：在全外顯子檢測的基礎(chǔ)上增加了一些有意義的內(nèi)含子檢測區(qū)域，檢測的范圍高于全外顯子檢測，即加強版的全外顯子檢測；
4.功能性基因檢測：如易感基因檢測、用藥指導(dǎo)、天賦基因等。
? 樣本類型 | 總量 | 具體操作 |
血液 | ≥1ml | EDTA抗凝管采血，顛倒混勻，凍存管分裝；液氮速凍，-80°C保存，干冰運輸。 |
口腔脫落細胞 | 2-4根棉簽拭子 | 在雙側(cè)面頰內(nèi)部中等力度 上下擦動，同時旋轉(zhuǎn)拭子 10-20 圈，讓拭子頭部充分接觸口腔黏膜；建議5日內(nèi)常溫寄到我司。 |
人體FFPE | 白片＞8片石蠟卷＞8卷 | 厚度5-10μm，表面積＞10mm×10mm；常溫保存及運輸，注意避免不同樣品間蠟片交叉污染；建議使用1年內(nèi)的FFPE樣本。 |
唾液 | 2ml | 唾液采集好后與保護液按1:1混合，上下顛倒至少10次充分混勻。建議5日內(nèi)常溫寄到我司； |
宏基因組測序就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組進行提取，以此為研究對象，對微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法，解讀微生物群體多樣性與豐度，探索微生物與環(huán)境及宿主之間的關(guān)系，發(fā)掘和研究新的且具有特定功能的基因。與傳統(tǒng)微生物研究方法相比，宏基因組測序技術(shù)規(guī)避了絕大部分微生物不能培養(yǎng)、痕量菌無法檢測的缺點，因此近年來在環(huán)境微生物學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。
1. 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：代謝病、腫瘤癌癥等；
2. 畜牧領(lǐng)域：腸道、瘤胃（如產(chǎn)甲烷菌類群）與動物健康/營養(yǎng)消化研究等；
3. 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：根際微生物與植物互作、農(nóng)業(yè)耕作/施肥處理與土壤微生物群落等；
4. 環(huán)境領(lǐng)域：霧霾處理、污水治理、石油降解、酸性礦水處理及海洋環(huán)境等；
5. 生物能源：特殊功能的菌株、基因挖掘、工程菌的開發(fā)；
6. 特殊極端環(huán)境：極端環(huán)境條件下的微生物類群研究。
1.環(huán)境樣本：土壤5-10 g，污泥/沉積物5-10 g，水體-濾膜過濾至有可見覆蓋物，糞便3-5 g，血液10 mL；
2.DNA：總量 ≥ 1 μg，濃度 ≥ 10 ng/μL，OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無降解，無污染；
3.送樣管務(wù)必標清樣品編號，管口使用Parafilm膜密封；
4.樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時使用干冰運輸。
5.具體項目合作，請聯(lián)系公司技術(shù)支持
1.樣品質(zhì)檢流程是怎樣的？
DNA檢測：Nanodrop檢測→Qubit檢測→瓊脂糖凝膠電泳檢測；
RNA檢測：Nanodrop檢測→瓊脂糖凝膠電泳檢測→Agilent 2100檢測；
文庫檢測：Qubit檢測→Caliper/NGS3K/Agilent 2100檢測→QPCR定量檢測。
2.文庫的最適插入片段長度范圍？
PE150平臺：DNA 350 bp；PE250平臺：270~470 bp; RNA 250~300 bp;SE50平臺： <530 bp（以上片段均指不包含接頭序列的插入片段長度）；
實際文庫制備時，HiSeq文庫大小介于300bp-500bp之間；MiSeq文庫大小介于300 bp-600 bp之間；鳥槍法建庫時，文庫應(yīng)小于1000bp。
3.自建庫有哪些注意事項？
（1）需要客戶提供文庫體積及初步檢測的濃度，并滿足送樣要求；
（2）需提供建庫接頭詳細正確的序列信息以及正向無誤的index序列，以確保文庫能在測序儀順利上機以及保證后續(xù)數(shù)據(jù)正常拆分。
4.16S測序哪個區(qū)域比較合適？
目前并沒有絕對的研究表明哪個測序區(qū)域更好。根據(jù)比較權(quán)威的研究表明土壤樣本，16S V4區(qū)（515F-806R）比較適合做擴增子研究，可檢測的物種多樣性更豐富，并且可重復(fù)性強（PNAS. 2013. 110(16): 6548-6553.）。Illumina官方推薦的是V3+V4區(qū)。
5.若關(guān)注環(huán)境中的真核微生物多樣性，ITS測序和18S測序哪個更好？
ITS測序主要是針對真菌多樣性的研究，注釋準確度高；18S測序針對的是真核微生物，注釋到的范圍廣，但是就真菌來說精確度相對較低；可根據(jù)研究目的合理選擇測序方案。
6.擴增子與宏基因組的區(qū)別？
擴增子主要分為16S、18S、ITS測序，關(guān)注環(huán)境樣本中的物種組成，該技術(shù)物美價廉，實用性高。宏基因組關(guān)注環(huán)境樣本中的物種組成、功能組成及代謝通路等信息，該技術(shù)深入挖掘環(huán)境樣本功能層面的信息。
7..宏基因組與微生物多樣性的區(qū)別？
宏基因組將基因組DNA隨機打斷成若干條小片段，然后在片段兩端加通用引物進行PCR擴增測序，將得到的reads進行組裝后進行基因預(yù)測得到基因序列，眾多基因構(gòu)成環(huán)境中微生物的基因集。
微生物多樣性主要針對核糖體小亞基基因序列進行測序（16s rDNA或者18s rDNA），該基因既存在高度保守的區(qū)域還包括高變區(qū)，通過特異性引物對某一段高變區(qū)（如V4區(qū)）或某幾段高變區(qū)（如V3-V4區(qū)）進行擴增測序，然后與數(shù)據(jù)庫比對，可特異性識別細菌種類。
總的來說，微生物多樣性主要告訴我們環(huán)境里有什么微生物，而宏基因組主要告訴我們環(huán)境里的微生物能做什么。
8.為什么宏基因組與微生物多樣性物種注釋結(jié)果存在差異？
微生物多樣性和宏基因組都會分析環(huán)境中物種的種類，但是物種的豐度在二者之間存在一定的差異： 第一種原因是微生物多樣性是基于核糖體小亞基基因序列進行物種注釋和豐度統(tǒng)計，但是在不同物種中核糖體基因的拷貝數(shù)不一樣，這會帶來一些誤差；第二種原因是二者在建庫測序過程中會進行PCR反應(yīng)，在PCR這個過程中也會存在一些誤差。
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