管理規(guī)范：通過(guò)ISO9001:2015質(zhì)量管理體系認(rèn)證；
質(zhì)量可靠：上下游實(shí)驗(yàn)均采用磁珠純化，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定結(jié)果更好；
菌液樣品需要注明抗性，如果需要特殊抗性搖菌請(qǐng)?jiān)谒蜆訒r(shí)一起送來(lái)公司，并告知工作濃度（本公司目前只Amp，Kan，Cm，Tc四種抗生素）；
需要測(cè)序的引物不是通用引物時(shí)，請(qǐng)單獨(dú)提供，并標(biāo)注濃度；
送樣管上編號(hào)請(qǐng)和登記單上保持一致，樣品編號(hào)可包含“字母”、“數(shù)字“—”，請(qǐng)勿出現(xiàn)其他特殊字符；
快速交付：質(zhì)粒樣品最快8小時(shí)出具結(jié)果，且有完善的LIMS系統(tǒng)，可以實(shí)時(shí)跟進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度以及結(jié)果的在線下載；
Sanger測(cè)序服務(wù)作為諾賽基因經(jīng)典項(xiàng)目，從1998年承擔(dān)國(guó)際人類基因組計(jì)劃中國(guó)區(qū)1%測(cè)序任務(wù)至今，其間承接多項(xiàng)國(guó)家級(jí)重大項(xiàng)目。業(yè)務(wù)涉及生物學(xué)各領(lǐng)域，包括DNA測(cè)序、RNA測(cè)序、甲基化測(cè)序等服務(wù)。諾賽基因擁有世界一流的儀器設(shè)備、超過(guò)20年對(duì)外測(cè)序服務(wù)經(jīng)驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)序流程、全程監(jiān)控的質(zhì)量保障和質(zhì)量控制系統(tǒng)，本著“客戶第一、服務(wù)至上”的企業(yè)宗旨，致力于為客戶提供高質(zhì)量、高性價(jià)比、高效率的測(cè)序服務(wù)。
???樣品類型 | 濃度 | 體積（最少量） | 長(zhǎng)度 | 備注 |
PCR原液 | 1ul電泳檢測(cè)應(yīng)為明亮的一條帶（≥20ng/ul） | ≥30ul | 100bp~3k | 5ul/反應(yīng) |
已純化PCR產(chǎn)物 | ≥10ng/ul | 10ul | 100bp~3k | 5ul/反應(yīng) |
質(zhì)粒 | ≥50ng/ul | 10ul | 插入＜6k | 5ul/反應(yīng) |
菌液 | 甘油菌和剛接種的菌液請(qǐng)注明 | 50ul | 插入＜6k | 只接收大腸桿菌；需注明載體和抗性，特殊抗性請(qǐng)自備并注明用量；對(duì)于拷貝數(shù)低和大的質(zhì)粒載體，請(qǐng)自行提供質(zhì)粒測(cè)序 |
1. 建議PAGE純化測(cè)序引物；
2. 引物濃度不低于5 pmol/ul，不少于10ul。樣品較多或反應(yīng)數(shù)多時(shí)需多提供，正常情況下，按1ul/個(gè)反應(yīng)計(jì)算；
3. 引物長(zhǎng)度一般在18-23bp比較適合測(cè)序，引物Tm=50~60℃，18~25mer，GC含量40~60%。無(wú)四個(gè)以上連續(xù)堿基，尤其3’端；
4. 隨機(jī)引物（RAPD引物）和簡(jiǎn)并引物，混合引物以及引物長(zhǎng)度不足17bp或大于35bp的不建議用于測(cè)序；
5. 勿使用有熒光標(biāo)記或其它標(biāo)記的引物；
人員穩(wěn)定：服務(wù)平臺(tái)的重要崗位人員均具有多年經(jīng)驗(yàn)，有效降低實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的人為誤差；
請(qǐng)?jiān)敿?xì)填寫(xiě)諾賽基因DNA測(cè)序登記單，為避免產(chǎn)生問(wèn)題訂單，大批量的樣品請(qǐng)?zhí)峁╇娮影鏈y(cè)序登記單；
測(cè)序通量：擁有多臺(tái)3730xl測(cè)序儀,可滿足大批量測(cè)序要求；
測(cè)序樣品存在特殊結(jié)構(gòu)，請(qǐng)?jiān)谟唵紊蟼渥?，如?/span>GC rich大于70%、甲基化、復(fù)雜結(jié)構(gòu)等；
1. 接收樣品當(dāng)天不計(jì)算在內(nèi)，12-48小時(shí)內(nèi)發(fā)送測(cè)序結(jié)果；
2. 測(cè)序結(jié)果我們以壓縮文件Zip形式發(fā)送，內(nèi)含測(cè)序結(jié)果和《DNA測(cè)序報(bào)告》，其中：
A．a(chǎn)b1為后綴的文件為測(cè)序圖譜，可使用CHROMAS, BIOEDIT, DNAMAN 等軟件打開(kāi)；
B． Seq為后綴的文件為堿基序列，可使用NOTEPAD(記事本)或者DNAStar等軟件打開(kāi)；
C．《DNA測(cè)序報(bào)告》為HTML文件，可使用Internet Explorer等網(wǎng)絡(luò)瀏覽器打開(kāi)，該報(bào)告包含樣品測(cè)序的詳細(xì)信息，同時(shí)作為我公司與您對(duì)測(cè)序服務(wù)交流的重要書(shū)面材料，請(qǐng)認(rèn)真查看；
3. 如需對(duì)您的樣品測(cè)序進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤和結(jié)果下載, 請(qǐng)登錄http://61.49.28.136/web, 輸入用戶名和密碼，即可進(jìn)入頁(yè)面進(jìn)行測(cè)序跟蹤和結(jié)果下載；
4. 典型的峰圖；
電話訂購(gòu)：010-67873039/4478；李經(jīng)理：13522520637；王經(jīng)理：15210696931
相關(guān)資料：諾賽基因DNA測(cè)序登記單；
1.為什么過(guò)短的PCR產(chǎn)物不適于直接測(cè)序？
首先，測(cè)序的引物是沒(méi)有熒光標(biāo)記的，所以我們測(cè)的序列是從引物后面的堿基開(kāi)始的，同時(shí)由于引物后面30至50bp堿基測(cè)序不準(zhǔn)確，考慮到后續(xù)有效序列比對(duì)的問(wèn)題，所以建議用于測(cè)序的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度一般不低于150bp；其次，過(guò)短的PCR產(chǎn)物純化比較困難，所以建議PCR產(chǎn)物片段不低于150bp；再次，太短的PCR產(chǎn)物測(cè)序受外界的干擾比較大，很容易造成測(cè)序失敗或不理想；綜上所述，我們建議用于測(cè)序的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度一般不低于150bp。如低于150bp建議您重新設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物或是克隆后再測(cè)序。
2.DNA片段很長(zhǎng)，一個(gè)反應(yīng)測(cè)不到頭，怎么辦？
可以分別用兩端引物進(jìn)行雙向測(cè)序，讓其中間部分的序列交叉互補(bǔ)，便可完全測(cè)通。如果這樣還測(cè)不通，可在已經(jīng)測(cè)出序列的500～700個(gè)堿基處設(shè)計(jì)測(cè)序引物做進(jìn)一步測(cè)序（即Primer Walking），直至完全測(cè)通。
3.為什么在primer walking時(shí)總將引物設(shè)計(jì)得那么靠前？
我們?cè)谠O(shè)計(jì)引物時(shí)有兩個(gè)準(zhǔn)則。一是用于設(shè)計(jì)引物的序列必須準(zhǔn)確，二是在引物區(qū)之后還必須有足夠的準(zhǔn)確序列用于拼接。這樣我們?cè)O(shè)計(jì)引物的位置就必然在已測(cè)序的準(zhǔn)確序列的末尾之前一段位置上，在滿足軟件設(shè)定的條件下，我們總會(huì)選取最靠近3’端的引物來(lái)作為最終的測(cè)序引物。
4.我有一個(gè)4KB的PCR片段，希望你們幫我測(cè)通。
大于3KB的PCR片段要測(cè)通最好是構(gòu)建到載體上再進(jìn)行測(cè)序。這樣模板更加穩(wěn)定，測(cè)序效果也更好一些。
5.PCR片段直接測(cè)序和PCR片段經(jīng)克隆后測(cè)序的結(jié)果有何區(qū)別？
眾所周知，PCR擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配現(xiàn)象，但所有錯(cuò)配都發(fā)生在同一位置的概率極低。PCR片段直接測(cè)序時(shí)，測(cè)得的是PCR產(chǎn)物眾多分子混合物的結(jié)果。若某一個(gè)位點(diǎn)上極少的一些PCR產(chǎn)物(約幾十個(gè)分子)在該位點(diǎn)上存在錯(cuò)配，但大多PCR產(chǎn)物（約幾十萬(wàn)個(gè)分子）在這個(gè)位點(diǎn)上還是正確的，因此測(cè)序時(shí)，錯(cuò)配現(xiàn)象是反映不出來(lái)的。而PCR片段經(jīng)克隆后測(cè)序是測(cè)定某一個(gè)PCR產(chǎn)物分子的DNA序列。在幾十輪循環(huán)的PCR擴(kuò)增過(guò)程中，很難保證某一個(gè)分子的任何位點(diǎn)都不發(fā)生錯(cuò)配。因此，PCR片段經(jīng)克隆后的測(cè)序結(jié)果，往往存在著一些錯(cuò)配的序列，和PCR片段直接測(cè)序的結(jié)果相比有些堿基會(huì)有所不同。這種錯(cuò)配現(xiàn)象的多少取決于PCR擴(kuò)增時(shí)使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴(kuò)增過(guò)程中的錯(cuò)配現(xiàn)象，在PCR反應(yīng)時(shí)選用保真性能高的DNA聚合酶。
6.我測(cè)得的基因序列為什么與標(biāo)準(zhǔn)序列有差別？
原因可能是：
①PCR擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生錯(cuò)誤；
②載體擴(kuò)增或保存過(guò)程中發(fā)生突變；
③ABI公司承諾其儀器的測(cè)序精度是≧98.5%。
解決措施有：
①排除模板、PCR擴(kuò)增或載體相關(guān)的錯(cuò)誤；
②雙向測(cè)序。
7. 我要求5’到3’正向測(cè)序，為什么你們給我的序列是反的？
我們是按照您所選擇的引物來(lái)測(cè)序的，有可能該序列與您手中資料上的序列的方向相反，也可能是目標(biāo)片段的插入方向與您預(yù)期的相反。填寫(xiě)測(cè)序要求時(shí)，請(qǐng)不要使用3’引物和5’引物這樣的字樣，而應(yīng)以T7，T3，SP6，M13f，M13r等形式來(lái)填寫(xiě)，或注明酶切位點(diǎn)方向比如“測(cè)序方向Eco RI到Hind Ⅲ”。如果您提供的載體比較特殊，還需要您提供質(zhì)粒的相關(guān)圖譜等資料和信息。
8. 為什么找不到我的PCR引物？
有以下幾種情況，我們將無(wú)法找到PCR引物序列：
（1）用PCR引物作為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序時(shí)，所測(cè)序列是從引物3’末端后第一個(gè)堿基開(kāi)始的，所以找不到測(cè)序引物的序列。有兩種方法可以得到測(cè)序引物序列。①對(duì)于較短的PCR產(chǎn)物（〈800bp），可以用另一端的引物進(jìn)行測(cè)序，一直測(cè)到序列的末端，就可以在序列的末端找到您的引物的反向互補(bǔ)序列或是在已測(cè)出的結(jié)果200bp左右設(shè)計(jì)反向引物，也可以在序列的末端找到您的引物的反向互補(bǔ)序列。②對(duì)于較長(zhǎng)的序列，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)測(cè)不到頭，可以將您的PCR產(chǎn)物克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中（比如T載體），用載體上的通用引物進(jìn)行測(cè)序。由于載體上的通用引物與插入序列之間還有一段距離，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測(cè)序的起始端總會(huì)有一些堿基無(wú)法準(zhǔn)確讀出，因此，您如果想得到您的PCR產(chǎn)物的完整序列，最好克隆后進(jìn)行測(cè)序。
（2）PCR產(chǎn)物用T載體克隆后，由于克隆的方向是隨機(jī)的，因此，當(dāng)您在一條鏈上找不到您的引物序列時(shí)，試圖在互補(bǔ)鏈上尋找您的引物序列。
（3）當(dāng)測(cè)序引物離您的插入片段很近時(shí)，有時(shí)可能也無(wú)法找到您的引物的全序列。這主要是因?yàn)橐淮鷾y(cè)序是測(cè)引物后面的序列，由于引物后面30~50個(gè)堿基測(cè)序不準(zhǔn)確或起始端有未去除的染料或引物二聚體的干擾，造成起始區(qū)的序列不好，可能無(wú)法找到您的引物完整序列。
（4）有時(shí)，質(zhì)粒做模板進(jìn)行測(cè)序時(shí)，由于某些原因，質(zhì)粒上沒(méi)有插入外源目標(biāo)片段，或?yàn)榭蛰d體，所測(cè)的序列完全為載體序列，此時(shí)自然也找不到引物序列。
9. PCR測(cè)序后面很多雜信號(hào)？
PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，序列結(jié)束后無(wú)反應(yīng)信號(hào)。PCR產(chǎn)物測(cè)序一般末端的一個(gè)堿基為A（綠色峰），這是由于Taq酶能夠在PCR反應(yīng)的末端非特異性地加上一個(gè)A堿基，我們用T載體克隆PCR產(chǎn)物就是根據(jù)該原理的，這樣我們很容易辨別PCR產(chǎn)物結(jié)束的位點(diǎn)。在此序列以外就不是我們所需要的序列了。
10. 測(cè)序結(jié)果不到700bp還照常收費(fèi)了，為什么？
如果樣品的DNA序列分布勻稱，沒(méi)有復(fù)雜結(jié)構(gòu)，正常的測(cè)序反應(yīng)能保證達(dá)到700bp以上。但有一些DNA樣品立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，造成聚合酶延伸反應(yīng)終止，測(cè)序信號(hào)突然減弱或消失，或者測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰現(xiàn)象。出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因由DNA模板本身所造成。對(duì)這些結(jié)果，諾賽會(huì)根據(jù)具體情況收取費(fèi)用。
出現(xiàn)這些情況的原因分析如下：
（1）G/C rich、G/C Cluster：這種情況一般表現(xiàn)為測(cè)序信號(hào)突然減弱或消失；
（2）A、T的連續(xù)結(jié)構(gòu)：這種情況一般表現(xiàn)為A、T連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰。根據(jù)文獻(xiàn)記載，原因在于聚合酶進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)，由于A或T的連續(xù)，聚合酶難以識(shí)別完整的每個(gè)A或T，在某個(gè)A或T的后面便開(kāi)始進(jìn)行A或T連續(xù)結(jié)構(gòu)以后序列的聚合反應(yīng)（打滑現(xiàn)象），造成測(cè)序結(jié)果紊亂，出現(xiàn)套峰。出現(xiàn)這樣的情況，建議反向測(cè)序；
（3）原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)信號(hào)突然減弱或消失。這種情況一般表現(xiàn)為已測(cè)出部分DNA堿基排列并無(wú)特別異常，從某一位置開(kāi)始聚合酶的聚合反應(yīng)便無(wú)法進(jìn)行，測(cè)序信號(hào)突然減弱或消失。
11. 我的樣品你們已經(jīng)測(cè)通了，但為什么在overlap區(qū)有這么多的錯(cuò)配，給出的全序列和單個(gè)報(bào)告也稱作差異，我該相信誰(shuí)？
給出的全序列是一個(gè)拼接的結(jié)果，當(dāng)互相拼接的兩個(gè)序列存在差異時(shí)，應(yīng)該以序列質(zhì)量更好為主。
12. 我的樣品送測(cè)序前已經(jīng)鑒定過(guò)了，有插入片段的，為什么你給我的測(cè)序結(jié)果是一個(gè)空質(zhì)粒？
鑒定過(guò)程中出現(xiàn)的假陽(yáng)性。鑒定插入片段主要是通過(guò)PCR和酶切兩種方式鑒定。由于PCR反應(yīng)受多種條件的影響，在鑒定過(guò)程中易產(chǎn)生假陽(yáng)性，而酶切鑒定是比較可靠的鑒定方式。
13.測(cè)序完成后，測(cè)序樣品和引物將如何處理（或保存）？
客戶需要將測(cè)序樣品或引物（客戶自帶的）返還時(shí)，我們?cè)跍y(cè)序完成的同時(shí)，按客戶要求返還樣品或引物（客戶自帶的）。對(duì)于未要求返回的測(cè)序樣品及隨工引物，如無(wú)特殊要求，公司負(fù)責(zé)保存3個(gè)月（菌類樣品保存1個(gè)月），我們將不再通知到期直接銷毀，如后續(xù)仍需安排實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)重新提供。
14.測(cè)序結(jié)果可以用哪些軟件打開(kāi)？
（1）ab1格式的峰圖打開(kāi)軟件有Sequence Scanner、DNASTAR、FinchTV、Chromas…；seq格式的序列軟件除了以上的之外還可以直接用文本格式的記事本直接打開(kāi)；
（2）序列拼接軟件Seqman、ContigExpress…
北京諾賽基因組研究中心有限公司
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