起步于承擔(dān)人類基因組計劃和多項全基因組測序重大項目，諾賽基因的DNA測序平臺是您的研究工作最可信賴的技術(shù)支撐和合作伙伴。世界一流的儀器設(shè)備與近十年對外測序服務(wù)經(jīng)驗的完美結(jié)合，輔助以標(biāo)準(zhǔn)化的流程和全程監(jiān)控的質(zhì)量保障和質(zhì)量控制系統(tǒng)，諾賽基因的大規(guī)模、高通量、自動化的DNA測序平臺致力于為國內(nèi)和國外客戶提供高質(zhì)量、高性價比、高效的測序服務(wù)。
多臺ABI 3730XL測序儀
日測序能力上千萬PHRE20堿基。
LIMS樣品信息管理系統(tǒng)
一個樣品，一個ID；QA現(xiàn)場監(jiān)督。
合格反應(yīng)，QV20+ > 800bp
QV20+，即堿基準(zhǔn)確度大于99%。
20年sanger測序經(jīng)驗
參與“國際人類基因組計劃”1%人類基因組測序任務(wù)
困難模板測序
發(fā)卡序列，高GC含量，重復(fù)序列。
合格率 > 90%
每板設(shè)陰性，陽性對照。
1.為什么過短的PCR產(chǎn)物不適于直接測序？
首先純化過短的PCR產(chǎn)物比較困難，一般的PCR產(chǎn)物純化試劑盒都要求PCR產(chǎn)物片段大于150bp，而且過短的PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量也非常困難。其次，模板太短的PCR測序受外界的干擾比較大，很容易造成測序失敗。因此我們要求用于測序的PCR產(chǎn)物的長度一般不低于150bp。（一代測序是測引物后面的序列，由于引物后面30~50個堿基測序不準(zhǔn)確，考慮到正反向測序能得到全長序列，所以要求用于測序的PCR產(chǎn)物的長度一般不低于150bp。）
2.DNA片段很長，一個反應(yīng)測不到頭，怎么辦？
可以分別用兩端引物進(jìn)行雙向測序，讓其中間部分的序列交叉互補，便可完全測通。如果這樣還測不通，可在已經(jīng)測出序列的500～700個堿基處設(shè)計測序引物作進(jìn)一步測序（即Primer Walking），便可完全測序。
3.為什么在primer walking時總將引物設(shè)計得那么靠前？
我們在設(shè)計引物時有兩個準(zhǔn)則。一是用于設(shè)計引物的序列必須準(zhǔn)確，二是在引物區(qū)之后還必須有足夠的準(zhǔn)確序列用于拼接。這樣我們設(shè)計引物的位置就必然在已測序的準(zhǔn)確序列的末尾之前一段位置上，在滿足軟件設(shè)定的條件下，我們總會選取最靠近3’端的引物來作為最終的測序引物。
4.我有一個4KB的PCR片段，希望你們幫我測通。
大于3KB的PCR片段要測通最好是構(gòu)建到克隆后再進(jìn)行測序。這樣模板更加穩(wěn)定，測序效果也更加好一些。
5.PCR片段直接測序和PCR片段經(jīng)克隆后測序的結(jié)果有何區(qū)別？
眾所周知，PCR擴增過程中會出現(xiàn)錯配現(xiàn)象，但不可能所有的錯配都發(fā)生在同一位置。PCR片段直接測序時，測得的是PCR產(chǎn)物眾多分子混合物的結(jié)果。若某一個位點上出現(xiàn)了錯配現(xiàn)象，一些PCR產(chǎn)物(約幾十個分子)在該位點上存在錯配，但大多數(shù)分子（約幾十萬個分子）在這個位點上還是正確的，因此測序時，錯配現(xiàn)象是反映不出來的。而PCR片段經(jīng)克隆后測序是測定某一個PCR產(chǎn)物分子的DNA序列。在幾十輪循環(huán)的PCR擴增過程中，很難保證某一個分子的任何位點都不發(fā)生錯配。因此，PCR片段經(jīng)克隆后的測序結(jié)果，往往存在著一些錯配的序列，和PCR片段直接測序的結(jié)果相比有些堿基會有所不同。這種錯配現(xiàn)象的多少取決于PCR擴增時使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴增過程中的錯配現(xiàn)象，在PCR反應(yīng)時，請選用保真性能高的DNA聚合酶。
原因可能是:
7. 我要求5’到3’正向測序，為什么你們給我的序列是反的？
我們是按照您所選擇的引物來測序的，有可能該序列與您手中資料上的序列的方向相反，也可能是目標(biāo)片段的插入方向與您預(yù)期的相反。填寫測序要求時，請不要使用3’引物和5’引物這樣的字樣，而應(yīng)以T7，T3，SP6，M13f，M13r等形式來填寫，或注明酶切位點方向比如“測序方向EcoRI到HindIII”。如果您提供的載體比較特殊，還需要您提供質(zhì)粒的相關(guān)圖譜等資料和信息。
該種情況主要發(fā)生在PCR產(chǎn)物直接測序上。由于PCR產(chǎn)物本身是一個混和溶液，相近的片斷又很難割膠純化出來，這樣和引物結(jié)合就很容易產(chǎn)生系列雜合序列就會造成在某些位置上有套峰，整個測序信號都非常好，這是由于套峰產(chǎn)生的N值。該種情況明顯是客戶的樣品問題。通過將PCR產(chǎn)物克隆后進(jìn)行測序，可以解決此種情況的N值問題。
有以下幾種情況，我們將無法找到PCR引物序列：
（1）用PCR引物作為測序引物進(jìn)行測序時，所測序列是從引物3’末端后第一個堿基開始的，所以自然找不到測序引物的序列。有兩種方法可以得到測序引物序列。①對于較短的PCR產(chǎn)物（<800bp），可以用另一端的引物進(jìn)行測序，一直測到序列的末端，就可以在序列的末端找到 您的引物的反向互補序列。②對于較長的序列，一個測序反應(yīng)測不到頭，可以將您的PCR產(chǎn)物克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中（比如T載體），用載體上的通用引物進(jìn)行測序。由于載體上的通用引物與插入序列之間還有一段距離，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測序的起始端總會有一些堿基無法準(zhǔn)確讀出，因此，您如果想得到您的PCR產(chǎn)物的完整序列，最好克隆后進(jìn)行測序。
（2）PCR產(chǎn)物用T載體克隆后，由于克隆的方向是隨機的，因此，當(dāng)您在一條鏈上找不到您的引物序列時，試圖在互補鏈上尋找您的引物序列。
（3）當(dāng)測序引物離您的插入片段很近時，有時可能也無法找到您的引物的全序列。這主要是因為有時測序的起始端有未去除的染料或引物二聚體的干擾，造成起始區(qū)的序列不好，可能無法找到您的引物完整序列。
10. PCR測序后面很多雜信號？
11. 測序結(jié)果不到800bp還照常收費了，為什么？
12. 我的樣品你們已經(jīng)測通了，但為什么在overlap區(qū)有這么多的錯配，給出的全序列和單個報告也稱作差異，我該相信誰？
13. 我的樣品送測序前已經(jīng)鑒定過了，有插入片段的，為什么你給我的測序結(jié)果是一個空質(zhì)粒？
造成這種現(xiàn)象主要有兩個原因：
? 鑒定過程中的假陽性。鑒定插入片段主要是通過PCR和酶切兩種方式鑒定。由于PCR反應(yīng)受多種條件的影響，在鑒定過程中易產(chǎn)生假陽性，而酶切鑒定是比較可靠的鑒定方式。
14. 測序完成后，測序樣品和引物將如何處理（或保存）？
客戶需要將測序樣品或引物（客戶自帶的）返還時，我們在測序完成的同時，按客戶要求返還樣品或引物（客戶自帶的）。對于沒返回的測序樣品，公司負(fù)責(zé)保存1個月（引物3個月），超過1個月還需測序的樣品，請客戶另行提供。
北京諾賽基因組研究中心有限公司
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